nuus

IPTG (isopropyl-β-D-tiogalaktosied) is 'n analoog van β-galaktosidase substraat, wat hoogs induseerbaar is.Onder die induksie van IPTG kan die induseerder 'n kompleks met die onderdrukkerproteïen vorm, Sodat die konformasie van die onderdrukkerproteïen verander word, sodat dit nie met die teikengeen gekombineer kan word nie, en die teikengeen doeltreffend uitgedruk word.So hoe moet die konsentrasie van IPTG tydens die eksperiment bepaal word?Is hoe groter hoe beter?
Eerstens, laat ons die beginsel van IPTG-induksie verstaan: E. coli se laktose-operon (element) bevat drie strukturele gene, Z,Y en A, wat onderskeidelik β-galaktosidase, permease en asetieltransferase kodeer.lacZ hidroliseer laktose tot glukose en galaktose, of in allolaktose;lacY laat laktose in die omgewing deur die selmembraan beweeg en die sel binnedring;lacA dra die asetielgroep oor van asetiel-CoA na β-galaktosied, wat die verwydering van toksiese effek behels.Daarbenewens is daar 'n operasievolgorde O, 'n beginvolgorde P en 'n regulerende geen I. Die I geenkode is 'n onderdrukkerproteïen wat aan die posisie O van die operateurvolgorde kan bind, sodat die operon (meta) onderdruk word en afgeskakel.Daar is ook 'n bindingsplek vir kataboliese geenaktivator proteïen-CAP bindingsplek stroomop van die inisieervolgorde P. Die P-volgorde, O-volgorde en CAP-bindingsplek vorm saam die regulatoriese gebied van die lac operon.Die koderende gene van die drie ensieme word deur dieselfde regulatoriese gebied gereguleer om die gekoördineerde uitdrukking van geenprodukte te bewerkstellig.

In die afwesigheid van laktose is die lac operon (meta) in 'n toestand van onderdrukking.Op hierdie tydstip bind die lac-onderdrukker uitgedruk deur die I-volgorde onder beheer van die PI-promotorvolgorde aan die O-volgorde, wat verhoed dat RNA-polimerase aan die P-volgorde bind en transkripsie-inisiasie inhibeer;wanneer laktose teenwoordig is, kan die lac operon (meta) geïnduseer word. In hierdie operon (meta) sisteem is die werklike induseerder nie laktose self nie.Laktose gaan die sel binne en word deur β-galaktosidase gekataliseer om na allolaktose omgeskakel te word.Laasgenoemde, as 'n induseerdermolekule, bind aan die onderdrukkerproteïen en verander die proteïenkonformasie, wat lei tot die dissosiasie van die onderdrukkerproteïen van die O-volgorde en transkripsie.Isopropyltiogalaktosied (IPTG) het dieselfde effek as allolaktose.Dit is 'n baie kragtige induseerder, wat nie deur bakterieë gemetaboliseer word nie en baie stabiel is, dus word dit wyd in laboratoriums gebruik.

Hoe om die optimale konsentrasie van IPTG te bepaal?Neem E. coli as 'n voorbeeld.
Die E. coli BL21 geneties gemanipuleerde stam wat die positiewe rekombinante pGEX (CGRP/msCT) bevat, is in LB vloeibare medium wat 50μg·mL-1 Amp bevat, geënt en oornag by 37°C gekweek.Die bogenoemde kultuur is geënt in 10 bottels 50mL vars LB vloeibare medium wat 50μg·mL-1 Amp bevat teen 'n verhouding van 1:100 vir uitbreiding kultuur, en toe die OD600 waarde 0.6~0.8 was, is IPTG by die finale konsentrasie gevoeg.Dit is 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Na induksie by dieselfde temperatuur en dieselfde tyd is 1 ml van die bakteriese oplossing daaruit geneem, en die bakteriese selle is deur sentrifugering versamel en aan SDS-PAGE onderwerp om die invloed van verskillende IPTG-konsentrasies op proteïenuitdrukking te ontleed, en dan kies die IPTG-konsentrasie met die grootste proteïenuitdrukking.
Na eksperimente sal gevind word dat die konsentrasie van IPTG nie so groot as moontlik is nie.Dit is omdat IPTG 'n sekere toksisiteit vir bakterieë het.Die oorskryding van die konsentrasie sal ook die sel doodmaak;en oor die algemeen hoop ons dat hoe meer oplosbare proteïen in die sel uitgedruk word, hoe beter, maar in baie gevalle wanneer die konsentrasie van IPTG te hoog is, sal 'n groot hoeveelheid insluiting gevorm word.Liggaam, maar die hoeveelheid oplosbare proteïen het afgeneem.Daarom is die mees geskikte IPTG-konsentrasie dikwels nie hoe groter hoe beter nie, maar hoe laer die konsentrasie.
Die doel van induksie en verbouing van geneties gemanipuleerde stamme is om die opbrengs van die teikenproteïen te verhoog en koste te verminder.Die uitdrukking van die teikengeen word nie net deur die stam se eie faktore en die uitdrukkingsplasmied beïnvloed nie, maar ook deur ander eksterne toestande, soos die konsentrasie van die induseerder, die induksietemperatuur en die induksietyd.Daarom, in die algemeen, voordat 'n onbekende proteïen uitgedruk en gesuiwer word, is dit die beste om die induksietyd, temperatuur en IPTG-konsentrasie te bestudeer om die toepaslike toestande te kies en die beste eksperimentele resultate te verkry.