Produkte

Om die metabolisme van die mikrobiese gasheer te verstaan ​​is noodsaaklik vir die ontwikkeling en optimalisering van heelselgebaseerde biokatalitiese prosesse, aangesien dit produksiedoeltreffendheid dikteer.Dit is veral waar vir redoks biokatalise waar metabolies aktiewe selle aangewend word as gevolg van die kofaktor/kosubstraat regeneratiewe kapasiteit endogeen in die gasheer.Rekombinante Escherichia coli is gebruik vir die oorproduksie van prolien-4-hidroksilase (P4H), 'n dioksigenase wat die hidroksilering van vry L-prolien in trans-4-hidroksi-L-prolien kataliseer met a-ketoglutaraat (a-KG) as kosubstraat.In hierdie heelsel biokatalisator verskaf sentrale koolstofmetabolisme die vereiste kosubstraat a-KG, wat P4H biokatalitiese prestasie direk aan koolstofmetabolisme en metaboliese aktiwiteit koppel.Deur die toepassing van beide eksperimentele en rekenaarbiologie-instrumente, soos metaboliese ingenieurswese en (13)C-metaboliese vloedanalise ((13)C-MFA), het ons die fisiologiese, metaboliese en bio-energietiese reaksie van die heelsel-biokatalisator ondersoek en kwantitatief beskryf na die geteikende bioomskakeling en het moontlike metaboliese knelpunte vir verdere rasionele pad-ingenieurswese geïdentifiseer. 'n Prolienafbraak-tekorte E. coli-stam is gekonstrueer deur die putA-geen wat proliendehidrogenase kodeer, te skrap.Heelsel-biotransformasies met hierdie mutantstam het nie net tot kwantitatiewe prolienhidroksilasie gelei nie, maar ook tot 'n verdubbeling van die spesifieke trans-4-L-hidroksiprolien (hip) vormingstempo, in vergelyking met die wilde tipe.Ontleding van koolstofvloei deur middel van sentrale metabolisme van die mutantstam het aan die lig gebring dat die verhoogde a-KG-vraag na P4H-aktiwiteit nie die a-KG genererende vloed verhoog het nie, wat dui op 'n streng gereguleerde TCA-siklus werking onder die toestande wat bestudeer is.In die wilde tipe stam het P4H sintese en katalise 'n vermindering in biomassa opbrengs veroorsaak.Interessant genoeg het die ΔputA-stam die gepaardgaande ATP- en NADH-verlies bykomend vergoed deur onderhoudsenergievereistes teen vergelykbare lae glukose-opnametempo's te verminder, in plaas daarvan om die TCA-aktiwiteit te verhoog. Die putA-uitklop in rekombinante E. coli BL21(DE3)(pLysS) is gevind belowend wees vir produktiewe P4H-katalise, nie net in terme van biotransformasie-opbrengs nie, maar ook ten opsigte van die tempo vir biotransformasie en prolienopname en die opbrengs van hip op die energiebron.Die resultate dui daarop dat, na 'n putA-uitklophou, die koppeling van die TCA-siklus aan prolienhidroksilasie via die kosubstraat a-KG 'n sleutelfaktorbeperkende en 'n teiken word om die doeltreffendheid van a-KG-afhanklike biotransformasies verder te verbeter.